半自动化 MINI1000、自动化洗涤设备 HT1000、全套的染色洗涤整体解决方案 AUTO1000

　　细胞分析对于细胞结构和功能的研究、生命活动规律和本质的探索、疾病的诊断与治疗、药物的筛选与设计等都具有十分重要的意义。近年来，人们越来越意识到细胞具有个体差异性，市场对于细胞分析的需求与日俱增。传统的细胞分析技术主要包括酶标仪、显微镜及流式细胞术。其中流式细胞术是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。流式细胞术所具有的高通量、快速、多参数检测的特性使得其在临床疾病的诊断、治疗方面具有重大意义。

　　包括近年来热度很高的肿瘤和免疫学相关研究拓展了流式细胞术在细胞分析中的应用，以 CAR-T 技术细胞治疗为例，在整个细胞处理过程中，至少需要进行如下操作：

　　随着高通量和自动化技术的创新，分子检测技术如 PCR 和测序技术进入高通量和自动化时代，使得利用相关技术进行的研究以及临床应用进入以往一个新的阶段。但对于具有完整生命体的细胞，由于高度异质性，且流式技术的数据质量较大依赖前期样品的准备，人为因素干扰较多，因此如何获得可信度高的数据是该技术更深入发展的一个重要阻碍。

　　显然，只有尽力减少人为操作的误差，实现操作标准化才有利于获得更加客观准确的数据。在主要为人工操作的样品处理过程中，存在的问题严重阻碍了最终数据的可靠性。问题主要集中在两个方面：（1）样品处理过程多依赖离心过程，操作繁琐，自动化难度大，成本高；（2）离心过程会对细胞产生较大压力，导致细胞状态不好，细胞留存率低，特别是对数量不多的稀有细胞以及需要多次染色的细胞实验带来很大的考验。

　　因此，解决方式是寻找一种新的洗涤方法，既不会对细胞产生较大压力又能轻易实现操作的标准化。韩国 Curiox 公司早在十多年前研发了特殊的无壁微孔板，利用亲水和疏水的材料隔离出每个单独的细胞孔，使得亲水性的细胞和培养基依靠微弱的表面张力结合在小孔中。该微孔板配套经过流体力学验证后的层流洗涤技术，在过去被用于多种细胞分析的应用，比如悬浮细胞的染色和检测、微量细胞的多因子检测等等。随着肿瘤免疫研究的大热，这套层流洗涤技术逐渐被拓展到对悬浮细胞检测需求更大的流式细胞术中。此项技术改变了以往人们对悬浮细胞的洗涤和分析认知。

　　本技术采用特殊的 DA 孔板，无实体孔壁，细胞孔区域为亲水材料，孔与孔之间为疏水材料。每孔两侧各带有一个喷头，分别用来加液和排液。孔底比加液/排液平台略低，细胞在孔底沉降/休息，溶液在细胞上方流过，抗体/碎片扩散至溶液的上部，经过多次循环洗涤后，孔底部的细胞碎片/溶于水的抗体/杂质都会被洗干净。由于液体吹打和抽吸的控制是经过流体力学研究验证后的力度，因此洗涤过程较少干扰沉淀中的细胞，并且对细胞几乎无任何损伤性的压力。该基于流体力学的流速和压力控制被《Blood》收录。

　　（二）从上面层流洗涤技术的原理不难看出，传统的离心洗涤过程中几乎暴力式的吹、弹、吸、压操作，在这里不存在，而是温和自然地基于流体力学、分子扩散、亲水疏水表面张力原理的细胞洗涤过程。由此而带来的优势是离心洗涤方式较难实现的，比如：

　　1.减少了传统的洗涤繁琐步骤，快速进行细胞洗涤—— 2-4 分钟内完成 7 次清洗，相当于离心法洗涤 2 次

　　2.标准化操作带来更低的 CV 值，针对数量不多的稀有细胞也可实现较低的 CV 值，如下图红框中三种低于 5% 比例的细胞亚群，传统离心洗涤方法分析获得的流式数据通常 CV 高于 20%，而通过层流洗涤方式可降低至 10% 甚至更低。

　　3.需要固定或者多色染色中细胞处理流程较多的实验，会损伤细胞，影响细胞健康状态，传统的暴力离心洗涤方雪上加霜。层流洗涤温和的洗涤过程减少了细胞损伤，从而提高细胞活力，提高细胞留存率。如下图即使在细胞总数只有 50-100 个的情况下，相比较传统的离心洗涤，层流洗涤可几乎保留所有的细胞，并且这些细胞保持了完整的形态和活力。

　　4.洗涤虽然温和，但是相比于传统离心法可进行更多次的洗涤过程，温和的过程减少了细胞碎片和细胞聚团的发生，因此清洗后背景干净，细胞分型更明显，使得一些以往处于模棱两可的染色结果更多得到确定的结果。

　　5.由于洗涤干净染色分辨率高，以及温和地操作过程减少了碎片和聚团，提高了细胞活力，因此对于检测脾脏细胞、TILs 和其他稀有细胞的实验，可以得到更好的数据结果和信噪比。

　　通过改进洗涤技术即可带来流式数据质量的改变。随着技术的发展，应用逐步拓展到样品前处理，目前根据不同领域客户对样品分析的需求，Curiox 提供半自动化 MINI1000，自动化洗涤设备 HT1000，以及全套的染色洗涤整体解决方案 AUTO1000，并且配备相应的兼容适配器，可整合自动化流式细胞术。其中 MINI1000 和 HT1000 可完成自动洗涤过程，MINI1000 每次样品处理量为 8-16 孔，HT1000 可实现 96 孔高通量自动洗涤；AUTO1000 在 HT1000 的基础上可实现染色过程自动化，可获得更好的数据一致性。