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发布时间:2024-03-30 18:14:47
产品型号:染色机
产品简介:  3. 以稀释的sheep anti mouse albumin第一抗体孵育1 hour,PBS洗三次,每次5min  4. 以稀释的bovine anti sheep-FITC 的二抗 孵育45m
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  3. 以稀释的sheep anti mouse albumin第一抗体孵育1 hour,PBS洗三次,每次5min

  4. 以稀释的bovine anti sheep-FITC 的二抗 孵育45min,PBS洗三次,每次5min

  胎肝细胞即时分泌蛋白也不会影响到结果吧,爬片之前细胞肯定洗过,然后到固定,蛋白不可能在胞外有广泛的分布,如果白蛋白多的到可以分泌出来,也不会在细胞里检测不到。

  你的一抗可能真的不适合做免疫荧光,不知还有没有别的抗体可以替换。如果你还有的抗白蛋白抗体,除了做免疫荧光,也可以将细胞裂解提蛋白,试着做一下双抗体夹心ELISA,这个方法敏感性不错,也许可以检测到低表达的蛋白。

  其实免疫荧光对一抗的要求不象western那么高,能作免疫沉淀的一般也能作荧光,可以考虑调整一下一抗浓度试试;

  1. 这个一抗是做免疫扩散等实验的,ICC等实验试剂说明上没说做过,不过他们说也可以。所以我想在这个实验中, BSA (或胎牛血清)的封闭可能影响到了一抗和抗原的结合,所以造成无荧光的现象?

  2. DAPI是我顺便看一下它的效果怎么样的。倒没想证明什么!不用DAPI衬染的就是上面那两张,颗粒好像没这么明显呀!

  1. 你用BSA封闭,部分BSA会结合在细胞上,如果单抗和BSA有交叉的话,同样会结合在BSA上,这样做下来,整个显色必须条件都有了:细胞-BSA-单抗-FITC标记二抗。现在你说没有荧光,那么单抗自然是不和BSA结合的。倒是BSA封闭后会不会影响单抗和细胞抗原的结合,就不好说了,一般情况下,BSA的封闭是不会影响单抗和抗原的特异性结合的(这是个竞争的问题,除非抗原和BSA存在比较特异性结合,才会影响单抗,你觉得BSA会和小鼠胎肝细胞中的白蛋白结合吗?应该不会吧)

  2. DAPI这个物质我也不太清楚,只是根据它的吸收峰,推测在515nm激发光下不会有太强的荧光,而且不该是绿色的。515nm的激发光好像本身就是绿色的吧?这个问题我也不是很清楚,还是问问高手。希望野原版主看到此帖能再给点意见吧!

  3. 你不用DAPI衬染的荧光片也会在胞核有颗粒状荧光吗?如果没有,那说明这些颗粒样的荧光应该是DAPI发出,那么对结果也没什么意义,不能证明你的胎肝细胞中有抗原表达呀。

  1. “用BSA封闭没有荧光结果,至少说明了单抗还是不和BSA交叉反应的,不然会整张片均有非特异性荧光”。为什么是这样的呀,如果单抗不与BSA反应的话,我应该可以拿BSA做封闭剂用的吧?

  2. 第三张图片应该是细胞核,我在显微镜下面仔细看过,和 DAPI 在420nM的图像完全一样(上传的照片倍数不太一样),如果 DAPI 在515nM 没有荧光的话,那是不是我的荧光结果是非特异性的(不过为什么只在细胞核中出现呢?)

  qjzhou2000主任不必客气,我只是尽自己所知说说罢了,可能有不对的地方,就迁就一下吧。

  1. 不一定单克隆抗体的特异性结合程度就好,一般单抗会有一定的使用范围,做免疫印迹很棒的可能偏就不适合做免疫荧光。(说道这里,你可以先试试将细胞中蛋白提出来,做个免疫印迹鉴定一下抗原在胎肝细胞中的表达情况)你用BSA封闭没有荧光结果,至少说明了单抗还是不和BSA交叉反应的,不然会整张片均有非特异性荧光。

  2. DAPI与DNA结合后吸收峰是358nm而散射峰是461nm,FITC吸收峰约在490nm处,用420nm的滤光片看到的应该是DAPI的蓝色荧光,非特异性的东西比较少,可能背景会是黑色。用515nm的滤光片,可能看到的是FITC的荧光,此时DAPI应该无荧光。

  3. 另外看到细胞上点状荧光,这里也不好说算不算特异性的荧光,我以前用Triton 处理过的细胞,也是这样,细胞中点点样的荧光,我觉得不太像是特异性的荧光。

  4. 不知道你封片之前是否将片子晾干了?以前看到帖子说,晾干后不会整个片子都雾蒙蒙的。另外盖玻片是否干净,盖玻片一定要很干净、透明才不会影响结果观察。

  1. 上次做的时候做过封闭过的(新生牛血清),未加一抗的对照,结果是没有荧光。所以这次就没有做这个,那我下次再做一次。

  2. 胎肝细胞的白蛋白表达量应该还好,我的一抗是单抗呀!他试剂说明上说是与牛血清白蛋白不交叉反应的,不明白为什么还能用这个全部封闭?

  1. 很想看看你封闭后的照片。我觉得前两张照片(未封闭)不像是特异性的荧光,感觉就是非特异性着色,你有没有试过不加一抗的对照,我觉得也会是这个效果。

  2. 个人认为是你的细胞抗原表达量低或抗原性不强,因而无特异性的荧光。再就是你的一抗特异性不强,二抗工作浓度偏高。(不知道为什么你的整张片子均是绿蒙蒙的,以前也是这样吗?)

  3. DAPI是可以和DNA结合的荧光物质,常用来对胞核进行标记,后面两张用DAPI尘染后的照片,发出的荧光应该是DAPI和细胞核结合的结果,加上使用triton X100打孔,更利于DAPI的结合。

  从最后两张图片来看,发荧光的是细胞核,我在显微镜下仔细看过,能不能说明在 BSA 封闭的情况下没有特异性荧光出现?(我买的一抗是单克隆抗体)

  另外,上面两张图片的荧光好像很弱的,是不是因为打孔的缘故?(我在PBS洗三次的时候,只有最后一次用的是加triton的)

  结果第1、2组均有荧光(不过荧光好像很弱,不知怎么回事?明天贴张图片,大家帮忙看看);第3组没有荧光发现!

  我用DAPI复染了一下,在425nm的滤光片下是蓝色,但在515nm下好像是与FITC一样的颜色? 不知大家有没有注意这个问题?

  我觉得不像是封闭的问题,胎牛血清不可能完全阻断一抗和抗原的特异性结合。应该是抗原或抗体出了问题,例如:抗原没有完全暴露或表达量低,一抗或二抗工作浓度太低,或者是抗体存放时间太长,效价太低。

  你检测的是小鼠胎肝细胞中的白蛋白,用牛血清白蛋白封闭会不会不太合适,不会有交叉反应吗?(不过从胎牛血清封闭结果看,似乎没有交叉),还是建议你试一下不封闭,免疫荧光封不封闭对结果影响不是很大,若真有非特异性结合,也是比较好辨认的。

  2. 封闭我们常用的是含1% BSA的0.15% (wt/vol) glycine ,室温30min


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